مقدمه:

*رنگ آمیزی گرام از مخلوط باکتریها

اولین مرحله در شناسایی باکتری ها رنگ آمیزی گرام است سپس می تانیم مراحل بعدی شناسایی را آغاز کنیم.

می دانیم که روش رنگ آمیزی گرام به ترتیب زیر است:

1-تهیه گسترش از باکتری

2-خشک شدن در هوا و فیکساسیون با حرارت

3-رنگ کردن با کریستال ویوله به مدت 1 دقیقه

4-شستشو با آب

5-اضافه کردن لوگل به عنوان دندانه به مدت 1 دقیقه

6-سرازیر کردن لوگل یا شستشوی آن

7-رنگبری با اتیل الکل 96% به مدت 20 الی 30 ثانیه

8-شستشو با آب

9-شستشو با سافرنین به مدت 30 الی 60 ثانیه

10-شستشو با آب

11-خشک شدن لام و مشاهده با عدسی 100

در رنگ آمیزی گرام ، علت عدم شباهت در رنگ پذیری باکتری های گرام + و گرام ، تفاوت در ضخامت دیواره آنهاست.

باکتری های گرام + دارای cellwall  ضخیم و حدودا 70 لایه هستند که رنگ کریستال ویوله را به خود می گیرند و بنفش رنگ می شوند.

باکتری های گرام دارای cellwall 1 تا 3 لایه هستند که رنگ سافرنین را به خود می گیرند و قرمز رنگ می شوند.

دیواره باکتری ها از واحدهای سازنده یک در میان Nاستیل گلوکز آمین و Nاستیل مورامیک اسید ساخته شده است که تتراپپتیدها به واحدهای Nاستیل مورامیک اسید متصل می شوند و شامل به ترتیب:

1-L-ala

2-D-gln

3- L-lys

4- D-ala

که اتصال بین تترا پپتیدها از شماره 3 به 4 است یعنی L-lys یک لایه به D-ala لایه بعدی متصل می گردد ، که این پیوند به نام "پل بین پپتیدی" توسط پنتاگلایسین صورت می گیرد. البته در گرام منفی ها به جای L-lys ، DAP دی آمینوپالمئیک قرار دارد.

نتیجه:

مشاهده شد که :

E-coli رنگ قرمز به خود گرفت و S-aureus رنگ بنفش داشت. زیرا E-coli گرام منفی و S-aureus گرام مثبت است.

*استفاده از KOH  3درصد برای تعیین واکنش گرام

در این روش نیز هدف شناسایی باکتری های گرام + از گرام می باشد. این روش تنها در مورد کلنی های خالص مورد استفاده است.

مراحل کار به صورت زیر است:

1-بر روی یک لام قطره ای KOH می ریزیم.

2-کلنی ای از باکتری ها را به کمک آنس برداشته و با KOH مخلوط می کنیم. در این مرحله لام را به صورت شیبدار نگه می داریم.

نتیجه:

مشاهده شد که:

باکتری های گرام منفی: بلافاصله پس از مخوط شدن با KOH غشای خود را از دست داده و قوام لزج و کشدار پیدا کردند. همانند E-coli

باکتر های گرام مثبت: پس از ترکیب شدن با KOH نیز دچار هیچ گونه تغییری در غشا خود نشدند و دست نخورده باقی ماندند. همانند S-aureus