تئوری آزمایش:

میکروبیولوژی خاک:

فوقانی ترین لایه خاک از لحاظ حضور میکروبها حائز اهمیت است. عوامل متعددی بر نوع و تعداد میکروارگانیسم ها دخالت دارند:

بافت فیزیکی- ترکیب شیمیایی- منشاء خاک- عمق خاک- مقدار و نوع مواد غذایی- رطوبت-حرارت- اثر میکروارگانیسم ها روی همدیگر- وجود ریشه گیاهان- اسیدیته خاک- میزان هوای موجود در خاک حاصلخیزی خاک- مداخله انسان ، ...

باکتری ها فراوانترین میکروارگانیسم های خاک هستند. و هر چه به عمق برویم از مقدار آنها کاسته می شود.

مهمترین میکروبهای خاک:

باکتریها (بیشترین)

اکتینومیست ها: باکتری هایی با منشاء خاک هستند. از نظر میزان Biomass در حد سایر باکتریها

قارچها: کمتر از 2 گروه قبل (حجم توده میسیلیال) ، کپک ها بیش تر از مخمرها هستند.

جلبکها: حضور وابسته به نور ، آب ، دی اکسید کربن است.

اساسا خاک زیستگاه مناسبی برای باکتریهای بیماریزای انسان و حیوان نیست. خاک زیستگاه فقیری است. پس حضور میکروارگانیسم ها در خاک به باکتری های اسپوردار محصور می شود.

نقش های مختلف میکروارگانیسم های موجود در خاک:

1.      تجزیه مواد آلی ( ممهمترین و حیاتی ترین نقش)

2.      دخالت آنها در Biogeochemical cycle ( چرخه های زیست ژئوشیمیایی : چرخه هایی هستند که در آنها به واسطه ایفای نقش میکروارگانیسم ها مواد شیمیایی و عناصر شیمیایی بین طبیعت بی جان و پیکره موجودات زنده هستند. )

3.      تجزیه مواد شیمیایی ساختگی


میکروبیولوژی آب:

حضور میکروبها در آبهای طبیعی ، دریا، رود، و محیط های آبی ساخته بشر و ... مربوط است. آبهای حاصل از نذورات آسمانی و آبهای فرورفته در اعماق زمین از نظر بار میکروبی کمترین تعداد را دارند.

تعریف آب سالم:  مهم ترین شاخص برای تعیین سلامت آب آشامیدنی، میزان حضور میکروب های بیماریزا در آن است. سنجش میزان سلامت آب از طریق شناسایی میکروبهای معرف انجام می گیرد و این میکروب های معرف کلیفرم و مشخصا ای کلای است. حضور ای کلای در آب در حقیقت نشان دهنده میزان آلودگی آب به مدفوع است.


روشهای بررسی میکروبیولوژیک خاک:

1-   روش کشت: با استفاده از تهیه رقت های متوال( Serial Dilution)  و شمارش کلنی ها با Colony counter . اگر هدف ما حضور جزئی به صورت کمی در یک مجموعه یا کل باشد باید از روش serial dilutionاستفاده کنیم. بنابراین این روش فقط محدود به میکروبیولوژی خاک نیست.

روش کار:

7 لوله برداشته و در تمامی لوله ها cc 9 آب مقطر می ریزیم. در لوله 1 ، gr1 از نمونه خاک مشکوک را می کشیم و در لوله ها می ریزیم. سوسپانسیونی از خاک در آب ایجاد می شود. Cc1 از لوله 1 را در لوله 2 می ریزیم. هر گروه cc1 از لوله خود برداشته به گروه بعدی می دهدگروه های مختلف cc1 که از سوسپانسیون خود برداشته اند را روی پلیت استریل می ریزند حدود cc10 آگار مذاب را روی آن ریخته و در مسیر 8 می چرخانند. سپس در انکوباتور قرار داده و بعد از 48 ساعت آن را بررسی می کنند.

نتیجه می گیریم: هر چه رقت بیشتر شود تعداد میکروارگانسیم ها کمتر می شود. در رقتهای آخر آنقدر کم است که می توانیم بشماریم.

2-   روش میکروسکوپی:

روش کار: از رقت 0.1 خاک ، همان سوسپانسیون اولیه تهیه شده از نمونه،  یک قطره برداشته و بر روی لا م می ریزیم، گسترش تهیه کرده، فیکس کرده، رنگ آمیزی گرام انجام می دهیم و بعد از رنگ آمیزی دنبال باسیلها و کلستریدیوم ها می گردیم.

 

روشهای بررسی حضور کلیفرم ها در آب:

1-   روش کشت: در این روش از دو نوع محیط برای کشت می توان استفاده کرد:

(1)              استفاده از محیط های انتخابی: یکی از مهم ترین ویژگی های تشخیصی حضور کلیفرم ها در هر چیزی ، نه تنها آب، قدرت تخمیر لاکتوز است. ساده ترین محیطی که لاکتوز دارد ، محیط لاکتوز براث است، محیط به رنگ قرمز است ، چون معرف فنل رد دارد و اگر باکتری لاکتوز را تخمیر کند، pH اسیدی می شود و محیط زرد رنگ می شود. ولی باید به خاطر داشته باشیم که تنها باکتری های کلیفرم محیط را زرد نمی کنند ، حتی استاف هم می تواند لاکتوز را تخمیر کند. بنابراین ، اگر محیط زرد نشد، با اطمینان می توان گفت که کلی فرم وجود ندارد و آب سالم است.

(2)              استفاده از محیط های افتراقی:

-        محیط EMB ( ائوزین متیلن بلو ): رنگ اولیه این محیط قرمز مایل به قهوه ای است. معرف موجود در آن ائوزین است. اگر لاکتوز تخمیر شود ، رنگ محیط بنفش می شود.

-        محیط Endo : رنگ اولیه این محیط گل بهی است. معرف موجود در آن فوشین است. اگر لاکتوز تخمیر شود ، رنگ محیط صورتی می شود.

این دو محیط هر دو دارای بازدارنده های رشد گرام مثبت ها هستند و هر دو دارای قند لاکتوز اند.  معرف در این دو محیط به صورت ترکیب با سولفید سدیم است. تخمیر در این دو محیط شدت و سرعت بالایی دارد، ترکیبات حاصل از تخمیر قند با سولفید سدیم ترکیب می شوند و در نتیجه معرف آزاد می شود و جانشینی شیمیایی رخ می دهد. معرف اکسید می شود و بسته به شدت و سرعت تخمیر قند لاکتوز ، رنگ سبز با جلای فلزی ایجاد می گردد. علت اصلی ایجاد سبز متالیک تخمیر قند لاکتوز است.  منظره سبز متالیک عمدتا در محیط EMB و در مورد ای کلای دیده می شود.

2-   روش شمارش تعداد: از نمونه آب هم رقت تهیه می کنیم عین روش مربوط به خاک ، با این تفاوت که در اکثر مواقع مجبوریم غلیظ کنیم. مبنای قضاوت تعداد کلیفرم های موجود در cc 100 آب است.

اگر میزان کلیفرم ها کمتر از 1 در cc100 باشد : آب بسیار سالم است.

اگر میزان کلیفرم ها بین 1 تا 2 در cc100 باشد: آب قابل قبول است.

اگر میزان کلیفرم ها  بین 2 تا 10 در cc100 باشد: آب غیر قابل است.

اگر میزان کلیفرم ها بیش از 10 در cc100 باشد : اصلا مورد مصرف قرار نمی گیرد.

3-   روش رنگ آمیزی: در رنگ آمیزی گرام از آب مشکوک به دنبال کوکوباسیلهای گرام مثبت می گردیم.

مشاهدات:

محیط کشت خاک:  به علت اینکه گروه های آخر را کشت دادیم، باکتری ها به نسبت گروه های اول کمتر مشاهده شد.

محیطEMB: کلاپسیلا کشت داده شده محیط بنفش رنگ بود و رنگ سبز متالیک دیده نشد.

محیط فنل رد : محیطی زرد رنگ با ایجاد گاز در انتهای لوله درهام مشاهده شد .