تئوری آزمایش:

* محیط کشت آگار خوندار (Blood Agar):

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میكروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار كشت داده می‌شوند، چون این محیط از رشد تمام واغلب باكتریهای سخت رشد حمایت كرده و اغلب میكروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژی كلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند . این  محیط کشت به منظور تکثیر و جدا سازی باکتریهای بیماریزا بخصوص باکتریهایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود. این محیط از یك محیط پایه مانند تریپتون كه منشاء پروتئینی دارد، كلرید سدیم آگار و 5 درصد خون (گاو، گوسفند، اسب یا خرگوش)  تشكیل شده است . پس از اتوکلاو محیط  پایه هنگامی که درجه آن تا حدود 50-48  درجه سانتیگرا د رسید ، 5% خون دفیبرینه گاو، گوسفند ، اسب ، خرگوش  را به نسبت 5 تا 7 درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیتهای استریل می ریزیم .

برخی باكتریها آنزیم های خارج سلولی تولید كرده كه بر روی گلبول‌های قرمز عمل كرده و آنها راكاملاً لیز می‌كند (همولیزبتا ) یا یك تغییر سبز رنگ در اطراف كلنی ایجاد می‌كند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی كه برخی از باكتریها تغییری ایجاد نمی‌كنند ( همولیزگاما)

1-همولیز کاملβ:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده واطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد میگردد.

 

2- همولیز ناقصα:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از 50 درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.

3-عدم همولیزγ :باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد.

تولید همولیزین بوسیله باكتری به بسیاری از فاكتورهای محیطی مانند PH ، اكسیژن و دما بستگی دارد. میكروب شناسان اغلب از مورفولوژی كلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت كمك به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یك باكتری استفاده می‌كنند. جهت مطالعه درست واكنش همولیتیك بر روی آگار خوندار، كارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید. اگر از لوپ جهت كشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط كه اكسیژن كمتری دارد رشدكند . تولید همولیزین های حساس به اكسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد .


مراحل تهیه:

1-استریل نمودن محیط پایه

2-خنک نمودن محیط استریل شده تا دمای 50-48 درجه سانتیگراد

3-افزودن خون حیوانات مختلف از جمله : گوسفند، اسب، گاو ، یا خرگوش به محیط در دمای مذکور و با رعایت شرایط استریل به میزان 5%

4-تکان دادن ظرف حاوی محیط با حرکات چرخشی ( مخلوط شدن یکنواخت خون)

5-ریختن محیط در پلیت های ( پتری دیش ) استریل به میزان 20-15 میلی لیتر در هر پلیت

 

 

 

نکات مهم:

1-     دقت لازم جهت جلوگیری از تشکیل حباب در حین ریختن پلیت

2-     نگهداری محیط آماده در یخچال حداکثر به مدت یک هفته

3-     لزوم بسته بندی پلیتها به منظور جلوگیری از تبخیر آب محیط

4-     نگهداری پلیت ها به صورت وارونه

*محیط کشت آگار شکلاته (Chocolate Agar) :

اگر به محیط پایه آگار خوندار هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو درحدود 80-70 درجه سانتیگراد باشد ، خون دفیبرینه گاو، گوسفند،اسبیا خرگوش  اضافه کنیم ، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید.

در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته ، برای رشد باکتریهایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد.

*رنگ آمیزی کپسول:

بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی را می پوشاند . این لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی دارد و همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ، کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .

کاربرد کپسول در باکتریها :

کپسول بعنوان یک سد اسمزی بین باکتری و محیط اطراف آن عمل می کند و در واقع نقش حفاظتی دارد. کپسول مانع از عمل بیگانه خواری گلبولهای سفید می شود همچنین بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد هم می تواند عمل کند.

در تعدادی از باکتریهای بیماریزا ، وجود کپسول شدت بیماریزایی و عفونت زایی را افزایش می دهد و ممکن است حتی این بیماریزایی به وجود کپسول بستگی داشته باشد . مثلا در استرپتوکوکوس پنومونیا اگر توانایی تولید کپسول در باکتری از بین برود این باکتری غیر بیماریزا می شود.

در عمل رنگ آمیزی شرط رنگ گیری یک سلول یونی بودن آن می باشد یعنی وقتی سلول حالت یونی داشته باشد هنگام رنگ آمیزی بین نواحی یونیزه سطح سلول و اجزای یونیزه مولکولهای رنگ پیوند بوجود می آید . در نتیجه بین بارهای مخالف موجود در سطح سلول و مولکولهای رنگ پیوند یونی تشکیل می شود و باکتری رنگ می گیرد . اما چون کپسول را بعلت غیر یونی بودن آن نمی توان رنگ آمیزی کرد در نتیجه برای دیدن آن در زیر میکروسکوپ ، زمینه باکتری رنگ آمیزی می شود و در نتیجه امکان دیدن کپسول باکتری که بصورت بیرنگ ظاهر می شود ، فراهم می شود. این روش را رنگ آمیزی منفی می نامند.در این روش رنگ آمیزی برای تثبیت گسترش از حرارت استفاده نمی شود . چون در اثر حرارت ، باکتری در داخل کپسول از شکل طبیعی خود خارج می شود.

روشهای کلی رنگ آمیزی کپسول:

1-   روش آنتونی

2-   روش هیس

3-   روش مرکب چین

4-   روش نیگروزون

5-   روش مویر

6-   روش مک فادین

روش مورد استفاده در این جلسه ، روش تایلر است:

 

1- با لوپ (نوک آنس) مقدار کمی از کشت باکتری باسیلوس آنتراسیس را روی یک لام تمیز پخش کرده ومیگذاریم  در مجاورت هوا خشک شود.

 

٢- سطح گسترش را با رنگ تایلر( مخلوط کریستال ویوله و اتانول) پوشانده و صبر کردیم تا 10 دقیقه بماند . بعد رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر آنرا شستشو دادیم.

 

٣- لام را با زاویه 45 درجه نگه داشته و گذاشتیم تا در مجاورت هوا خشک شود .

 

4-سولفات مس 2% را به مدت 3 دقیقه به گسترش مذکور افزودیم. به منظور حفظ شکل و حالت کپسول.

 

5-مشاهده با میکروسکوپ

در این روش سلول به رنگ بنفش ، زمینه بی رنگ و کپسول به صورت لایه ای شفاف دور باکتری دیده می شود.

zlng9wavxpvf9mjyf6k.jpg