تئوری و روش کار:

تعریف کشت و ایزوله کردن باکتری ها :

برای شناسایی عامل مولد یک بیماری باید باکتری ها را کشت داد یعنی مواد غذایی در اختیار ان قرار دهیم تا بتواند رشد کند محیط کشت خالص یک باکتری به محیطی گفته می شود که فقط دارای یک نوع میکروارگانیسم باشد و معمولا از روش کشت خطی استفاده می کنیم .

کشت خطی به دو صورت انجام می شود :

1.کشت در داخل پلیت

2.کشت در داخل لوله

كشتهای عمقی عمودی (Stab Cultures) :

 حدود 5 الی 10 میلی لیتر از محیط كشت نیمه جامد را در لوله آزمایش ریخته و به طور عمودی می‏گذارند تا محیط بسته شود.  سپس میكروارگانیسمها را توسط آنس میله ای به طور عمقی در مركزاین محیط كشت می‏دهند.

در عمق باکتری های بی هوازی رشد می کنند.

در سطح باکتری های هوازی رشد می کنند.

مهم ترین و معمول ترین محیط کشت نیمه جامد مورد بررسی SIM است. سه ویژگی باکتری ها را به صورت همزمان در این روش می توان بررسی کرد.

1-   توان تولید در سولفید هیدروژن، اگر باکتری بتواند از ترکیبات موجود در محیط H2S ایجاد کند. H2S در ترکیب با آهن موجود در محیط FeS  ایجاد می کند که به صورت رسوبی سیاه رنگ دیده می شود.

2-   توان تولید ایندول، اگر باکتری بتواند اسید آمینه تریپتوفان را تبدیل به ترکیب ایندول کند، ایندول مثبت است. معرف کوواکس ، معرفی است که اگر به محیط افزوده شود در قسمت بالای محیط  حلقه آلوانوئید تشکیل می شود. تا حد امکان باید تشخیص تست ایندول را به تاخیر نیاندازیم. چون ممکن است حجم ایندول تولیدی کم باشد و نتیجه نگیریم.

3-   ویژگی سوم Motility  یا همان قدرت حرکت باکتریهاست. برای تشخیص  با توجه به نحوه کشت باکتری در محیط به توان حرکتی آن پی مس بریم. اگر باکتری متحرک باشد ، کدورت حاصل از رشد یا سیاهی مربوط به تشکیل FeS  در مورد باکتری های سولفید مثبت محدود به مسیر حرکت آنس است. ولی اگر باکتری متحرک باشد، کدورت یا سیاهی مذکور پخش می شود.

 

v   روش کشت خطی :

در این روش از محیط پیش ریخته جامد در داخل پلیت استفاده می شود. به این ترتیب که ابتدا بوسیله یک آنس سترون شده مقداری از پرگنه باکتری را برداشته و آنرا روی سطح محیط پیش ریخته بصورت خطهای موازی و در چند جهت می کشید . در کشتهای خطی برای بدست آوردن کلنی های تک می توانید پلیت را به 4 قسمت تقسیم کنید بعد در قسمت اول ابتدا نوک آنس را که محتوی پرگنه باکتری است را بصورت خطهای موازی کشیده و بعد خطوط را در منطقه دوم از انتهای خط انتهایی منطقه اول در جهت دیگر ادامه می دهید و در منطقه سوم و چهارم هم به همین صورت عمل می کنید .قبل از مراحل اول ،دوم و سوم (به غیر از مرحله آخر) آنس باید استریل شودو حتما خنک شود.

 خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط موازی را روی سطح محیط می کشید به ترتیب از تراکم باکتریها کاسته می شود و به انتهای خط که می رسید تراکم باکتری کمتر است و در منطقه دیگر وقتی از انتهای خط منطقه قبلی استفاده می کنید در واقع تراکم بسیار کمتر از تراکم باکتریها در ابتدا می باشد و در نتیجه در مناطق دیگر هم به ترتیب از تعداد باکتریها کاسته می شود تا جائی که در منطقه چهارم شما می توانید پرگنه های تکی داشته باشید که کلنی خالص نامیده می شود. بنابراین انجام درست کشت خطی منجر به ایجاد کلنی خالص می شود این کلنی تنها از یک باکتری مادری بوجود می آید .

باکتریهای  منفرد را باکتریهای مادر می نامند که این باکتریها پس از کشت خطی و جدا شدن سلولهای باکتری از یکدیگر بوجود می آیند.

در واقع کلنی خالص به کلنی گفته می شود که با کلنی دیگر تماس نداشته باشد.

چند نکته در مورد تهیه کشت ایزوله خطی:

1.      تا حد امکان از حاشیه های محیط استفاده شود.

2.      تا حد امکان از لبه پلیت به لبه ی دیگر بروید. خطوط را وسط پلیت رها نکنید.

3.      در ابتدای هر مرحله به استثنا مرحله آخر ، آنس را می سوزانید اجازه دهید خنک شود و یکی دو بار با یکی از خطوط انتهایی مرحله قبل تماس دهید.

4.      در شروع مرحله چهارم چون از تراکم باکتری های موجود در نوک آنس به حد کافی کاسته شده نیازی به سوزاندن آنس نیست بنابراین تماس هم نمی دهیم.

5.      ناحیه ای که می خواهیم کار کنیم روبروی ما باشد. آنس با سطح محیط  کشت جامد زاویه ی حاده می سازد. آنس همیشه به ما نزدیک می شود.

6.      آنس در مسیر حرکت خود در مرحله آخر نباید با مراحل ما قبل آخر و همینطور مرحله اول تماس داشته باشد.

 

کشت در محیط های  مایع به صورت زیر است:

در مورد محیطهای کشت باکتریایی که بصورت مایع می باشند برای انجام کشت خطی روی محیط پیش ریخته فقط یکبار لوپ استریل و خنک شده را داخل محیط محتوی باکتری کرده و یک لوپ از آن بردارید سپس آنرا روی محیط پیش ریخته قرار داده و بصورت خطوط موازی آنرا در چند جهت بکشید. رشد باکتری در محیط مایع به صورت ایجاد کدورت بررسی می شود. در صورت کدر شدن محیط باکتری رشد کرده است. قبل از بررسی نتیجه نیاز به ضربه زدن به لوله است.

v   بررسی اثر حرارت بر روی باکتری ها:

مهم ترین اثر ضد میکروبی است. دو باکتری E.coli و باسیلوس سوبتلیس در محیط کشت نوترینت براث کشت می دهیم. ( مطابق روش کشت در محیط مایع)  10 دقیقه در بن ماری 80 درجه قرار داده که تحت تاثیر حرارت قرار گیرد ، سپس لوله ها را در انکوباتور قرارداده 48 ساعت بعد نتیجه ها را بررسی می کنیم. باسیلوس سوبتیلیس قادر به تحمل حرارت است، به علت اسپور دار بودن، در حالی که E.coli از بین می رود.